超越PROTAC——基于功能效应物的异功能分子设计

多特异性分子，是一类通过诱导两个或更多的蛋白质分子相互靠近，以提高治疗潜力的药物。自2001年，异功能分子以来吸引了越来越多的关注（图1）。在这些异功能分子中，PROTACs就是其中最成功的的代表.

尽管PROTACs为小分子药物设计开辟了一条新的途径，但它们并不适用于所有的蛋白质类别。此外，PROTACs的效果取决于特定的E3连接酶亚基，因此受到E3表达的影响，这限制了它们在特定细胞类型的应用。因此，迫切需要开发更多招募其他效应物的异功能分子，以补充PROTACs的不足之处。

日前，Wang等发表于J. Med. Chem.评论性文章概述了一些成功开发的异功能分子和工作流程，并着重介绍了了目前的设计策略、优势及待解决的问题。

除了UPS，自噬机制、内体/溶酶体、磷酸化途径和核糖核酸酶（RNase）L也被发现可以降解靶蛋白或调节翻译后修饰（PTMs），使这些细胞系统的组成部分成为设计异功能分子的潜在效应器。

除了蛋白酶体，内体/溶酶体途径也是一个重要的蛋白质降解平台（图3A）。与泛素介导的蛋白体降解相比，内体/溶酶体途径作用于更广泛的底物。在自然溶酶体降解机制的基础上，LYTACs是通过将LTR配体与POI结合分子相连而设计的（图3B）。理想情况下，LYTACs可以通过将POI与LTR桥接来发挥溶酶体作用，诱导溶酶体介导的降解（图3C）。目前，已经成功开发第一代LYTACs（M6Pn-LYTAC）和第二代LYTACs（GalNAc-LYTACs）（图3D）。

LYTACs的提出补充了PROTACs的功能，解决了PROTACs不能针对细胞外和膜相关POI的问题。LYTACs作为一种能够扩大可降解蛋白范围的有效工具，有着巨大的前景。考虑到LTR在大多数细胞表面广泛表达，防止LYTACs针对只表达LTR而不表达靶标蛋白的细胞，提高LYTACs的选择性和安全性也是亟待解决的问题。非特异性糖基修饰的抗体在小鼠体内会被迅速清除，确定如何调整LYTACs的药代动力学以控制脱靶清除率是另一个需要解决的问题。因此，需要开发更有力的小分子LYTACs。

自噬系统在溶酶体介导的细胞内物质的降解中起着主要作用。在自噬中，蛋白质的降解是从底物的基于S-鸟嘌呤化的K63聚泛素化开始的，然后泛素化的货物被参与自噬体的受体识别，并在后续过程中被降解（图4A）。基于自噬系统的重要功能，Arimoto小组提出了一种新型的异功能分子，称为AUTAC；AUTAC通过招募自噬体选择性地降解POI（图4B）。

第一代AUTACs选择鸟嘌呤衍生物（cGMP）作为自噬标签来诱导内源性S-鸟苷化。随后，研究人员又开发了自噬靶向嵌合体（AUTOTACs），它可以直接将受体p62拴在POI上并诱导POI的选择性自噬（图4C，D）。

AUTACs/AUTOTACs的概念进一步扩大了异功能分子的POI范围，包括聚集的蛋白质、细胞内的碎片，甚至受损的细胞器。然而，AUTACs的发展仍然面临许多挑战。例如，AUTACs的效率仍需提高、 AUTOTACs的持续性质需要进一步阐明、脱靶和选择性问题仍有待阐释，AUTACs对体内整体自噬过程的影响也有待于探索。最后，自噬的一些关键机制还不清楚。

RNAs，包括小RNAs，如microRNAs (miRNAs)，短干扰RNAs (siRNAs)，和长非编码RNAs，在细胞过程中发挥着非常重要的作用。一个有希望的特异性降解RNA的新策略涉及被称为RIBOTACs的异质功能分子，它由一个RNA靶向配体、一个RNase招募分子和两个分子之间的连接体组成（图5A）。RIBOTACs的功能是将内源性RNase招募到特定的RNA上，激活RNase并诱导目标RNA的选择性裂解（图5B）。

RNase L是一种受调控的内切酶，可降解单链病毒和细胞RNA。RNase L的功能是二聚体，在ATP催化下，RNase L的非活性单体形式通过2′,5′-oligoadenylate调解而二聚（图5C）。因此，合成的短的2′-5′A4寡核苷酸被用作RNase L招募剂，生成化合物2（12，图5D），这是第一个RIBOTAC。

总的来说，RIBOTACs为通过调节mRNA来解决无法治愈的致病性蛋白质提供了一种替代策略。然而，对于RIBOTACs的优化，在渗透性、选择性、脱靶问题等方面还需要更多的努力。

磷酸化和去磷酸化是最重要的PTMs，因为它们参与调节多种生物功能。磷酸化是由激酶和蛋白磷酸酶可逆地介导的。激酶向靶标蛋白添加磷酸盐基团，而蛋白磷酸酶从靶标蛋白上去除磷酸盐基团（图6A），Yamazoe等人 在2019年进行了一项概念验证研究（图6B）。该小组将PP1招募到AKT（化合物1（15）和化合物4a（16，第一个PHORC））和EGFR（化合物7（17），图6D）。

PHORCs已成为通过改变POI的磷酸化状态而不是其表达水平来精确调节POI功能的有效工具，为避免PROTAC诱导的蛋白质降解而可能产生的副作用提供了解决途径。然而，在PHORCs的开发中仍有许多问题需要解决，PHORCs的一些机制仍需精确阐明、非本地底物的去磷酸化、蛋白磷酸酶配体的相对短缺以及需要考虑PHORCs的可药性。

2020年，PHICS被提出为一种由激酶激活剂、POI结合剂和化学连接剂形成的异功能分子（图7A），它通过诱导底物的易位使其接近而招募激酶来磷酸化POI（图7B）。PHICS1（20）和PHICS2（21）是第一个设计的PHICS，分别采用内源性丝氨酸/苏氨酸激酶AMPK和PKC，使BRD4磷酸化；其他一些PHICS也相继被开发出来（图7C）。

在激酶招募机制的基础上，PHICS可以成为调节POI磷酸化状态的有效工具，它将保留双功能分子的一些优势，如同种异体的特异性、高选择性和快速动力学。此外，它们在重塑激酶特异性方面具更大潜力，可以调节上游激酶未被披露的POI的磷酸化。尽管如此，与靶向蛋白降解相比，只有少数PHICS被开发出来进行概念验证。它们在体内的效力和可药性仍有待验证。

赖氨酸乙酰化和去乙酰化的动态平衡是由赖氨酸乙酰转移酶（KATs，将乙酰基从乙酰CoA转移到赖氨酸）和赖氨酸去乙酰化酶（KDACs，将乙酰基从乙酰赖氨酸中去除）相互控制。KATs和KDACs的失调导致了各种疾病，如癌症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和代谢性疾病（图8A）。为了实现乙酰化调控，Wang等人提出了一个乙酰化标签系统AceTAG，通过异功能分子诱导靶蛋白的乙酰化。第一个AceTAG利用了一个与FKBP12F36V结合配体相连的KAT抑制剂（图8B）。这些异功能分子调节了内源性KATs和FKBP12F36V标记的POI之间的距离，从而诱导了基于底物接近的乙酰化（图8C）。

展 望 未 来

目前，异功能分子正在成为新药开发最受关注的领域之一。但作者也表示，这一领域也具有诸多挑战。未来对异功能分子的研究将主要集中在以下几点：

文章来源：博药

编辑：三 七