上周四，何博士为大家在北鲲云的直播间分享了Amber热力学积分计算相对自由能变化（直播回放可在视频号：北鲲云-直播回放中查看）。
直播结束后有很多小伙伴来向我们要PPT资料，这里何博士也为大家准备了文字版本的教程。将为大家介绍如何在北鲲云计算平台上利用Amber热力学积分计算相对自由能变化，体系包括小分子-蛋白（小分子改变），小分子-蛋白（蛋白突变），蛋白-蛋白相互作用。
本教程要求使用者一定程度了解Amber动力学模拟程序。
Amber是美国加州大学Peter Kollman等开发的一款著名的分子动力学模拟软件包。Amber主要适用于蛋白质，小分子和多糖等生物分子体系的模拟。
本文所需的所有文件请在https://github.com/Xinheng-He/ti_toturial上下载。
该应用场景解决将蛋白口袋内的小分子A变为小分子B所产生的相对自由能变。
首先，使用pymol将分子打开，并选中小分子，保存为mol2文件，如下图所示，我们使用
save *
my_case\
ben_ligand
.mol2
save *\
my_case\
benfen_ligand
.mol2
module add Anaconda3/2020.02
source /public/software/.
local/easybuild/software/amber/aber20/amber.sh
ulimit -s unlimited
ulimit -l unlimited
对苯生成具有电荷的可用mol2文件，总电荷为0，残基名为BEN。
antechamber -i ben_ligand.mol2 -fi mol2 -o ben_real.gaff2.mol2 -fo mol2 -rn BEN -at gaff2 -an
yes -dr
no -pf
yes -c bcc -nc
0
parmchk2
-i
ben_real
.gaff2
.mol2
-f
mol2
-o
BEN
.gaff2
.frcmod
-s
gaff2
-a
yes
antechamber
-i
benfen_ligand
.mol2
-fi
mol2
-o
benfen_real
.gaff2
.mol2
-fo
mol2
-rn
FEN
-at
gaff2
-an
yes
-dr
no
-pf
yes
-c
bcc
-nc 0
parmchk2
-i
benfen_real
.gaff2
.mol2
-f
mol2
-o
FEN
.gaff2
.frcmod
-s
gaff2
-a
yes
根据frcmod文件，生成两个分子的文库文件，该文件描述了分子内部的原子类型和键连信息。
tleap -f - <<_EOF
source leaprc.gaff2
loadamberparams FEN.gaff2.frcmod
FEN = loadmol2 benfen_real.gaff2.mol2
saveoff FEN FEN.lib
savepdb FEN FEN.pdb
quit
_EOF
tleap -f - <<_EOF
source leaprc.gaff2
loadamberparams BEN.gaff2.frcmod
BEN = loadmol2 ben_real.gaff2.mol2
saveoff BEN BEN.lib
savepdb BEN BEN.pdb
quit
_EOF
将两个pdb文件（FEN.pdb和BEN.pdb）中同样位置的全部重原子，保存成同样的坐标，注意名字要和lib中的一样，放成一个lig.pdb，在下面的tleap过程中，tleap会自动根据lib文件将complex中的原子变成真实的样子，这样做是为了保证一样原子的位置完全一致，减少不必要的变量。
使用pdb4amber，检查蛋白是否有二硫键，或需要编辑的残基。
pdb4amber
pure_protein
.pdb
-o
pure_check
.pdb
cat
pure_check_sslink
没有二硫键，之后使用pure_check.pdb。
tleap -f - <<_EOF
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff2
source leaprc.water.tip3p
loadAmberParams frcmod.ionsjc_tip3p
loadoff BEN.lib
loadoff FEN.lib
loadamberparams BEN.gaff2.frcmod
loadamberparams FEN.gaff2.frcmod
ligands = loadpdb lig.pdb
complex = loadpdb pure_check.pdb
complex = combine {ligands
complex}
check
complex
solvatebox ligands TIP3PBOX
15
addions ligands Na+
0
savepdb ligands ligands_vdw_bonded.pdb
saveamberparm ligands ligands_vdw_bonded.parm7 ligands_vdw_bonded.rst7
solvatebox
complex TIP3PBOX
15
addions
complex Cl-
0
savepdb
complex complex_vdw_bonded.pdb
saveamberparm
complex complex_vdw_bonded.parm7 complex_vdw_bonded.rst7
quit
_EOF
注意根据实际电荷情况调整addions，如果ligand/complex带负电，加Na+，反之加Cl-，离子类型可以自己选择。
下载complex_vdw_bonded.pdb并检查其中的配体分子区别，是否只是不一样的配体部分不一样，确定配体不一样部分的原子。设置出发和结束原子。
红框是有区别的原子，其他原子需要手动编辑使其保持一致的坐标，红线是编辑后的原子。
timask1 =
':BEN', timask2 =
':FEN',
scmask1 =
':BEN@H6', scmask2 =
':FEN@O1,H6'
使6个in文件符合实际更改的原子情况，只改变不同的原子，该步骤的目标是优化vdw变化过程中氢原子的位置。
使用sbatch run_v100.slurm，将任务提交到北鲲云的单卡V100集群上，该任务大概耗时1分钟，注意该任务如果有报错，可能是以下问题：
如果上述过程报关于ambmask的错（比如mask中不能用_符号），可以改写ambmask来获得正确可识别的mask。
ambmask
-p
complex_vdw_bonded
.parm7
-c
complex_vdw_bonded
.rst7
-find
:FEN
是ambmask的输入方式，在parm7和rst7中寻找这些原子，并用pdb的形式输出。
如果报错Error : Atom 12 does not have match in V1 ，说明这个原子在两个小分子配体中间的位置区别太大，TI不能识别这两个分子作为一样的背景，因此将这两个原子（初始和结束配体的）加入坐标中，就可以解决这个问题。
p
ligands_vdw_bonded
.rst7
ligands_vdw_bonded
.rst7
.leap
cp
press_lig
.rst7
ligands_vdw_bonded
.rst7
cp
complex_vdw_bonded
.rst7
complex_vdw_bonded
.rst7
.leap
cp
press_com
.rst7
complex_vdw_bonded
.rst7
cpptraj
-p
ligands_vdw_bonded
.parm7 <<_
EOF
trajin
ligands_vdw_bonded
.rst7
strip "
:1,2"
outtraj
ligands_solvated
.pdb
onlyframes 1
unstrip
strip "
:2-999999"
outtraj
ligands_BEN
.pdb
onlyframes 1
unstrip
strip "
:1,3
-999999"
outtraj
ligands_FEN
.pdb
onlyframes 1
_
EOF
cpptraj
-p
complex_vdw_bonded
.parm7 <<_
EOF
trajin
complex_vdw_bonded
.rst7
strip "
:1,2"
outtraj
complex_solvated
.pdb
onlyframes 1
unstrip
strip "
:2-999999"
outtraj
complex_BEN
.pdb
onlyframes 1
unstrip
strip "
:1,3
-999999"
outtraj
complex_FEN
.pdb
onlyframes 1
_
EOF
再次使用tleap生成decharge,vdw和recharge的文件,decharge是配体1，recharge是配体2，修改阅读的pdb的名字即可。
tleap -f - <<_EOF
# load the AMBER force fields
source leaprc.protein.ff19SB
source leaprc.gaff2
source leaprc.water.tip3p
loadAmberParams frcmod.ionsjc_tip3p
loadOff BEN.lib
loadOff FEN.lib
loadamberparams BEN.gaff2.frcmod
loadamberparams FEN.gaff2.frcmod
# coordinates for solvated ligands as created previously by MD
lsolv = loadpdb ligands_solvated.pdb
lbnz = loadpdb ligands_BEN.pdb
lphn = loadpdb ligands_FEN.pdb
# coordinates for complex as created previously by MD
csolv = loadpdb complex_solvated.pdb
cbnz = loadpdb complex_BEN.pdb
cphn = loadpdb complex_FEN.pdb
# decharge transformation
decharge = combine {lbnz lbnz lsolv}
setbox decharge vdw
savepdb decharge ligands_decharge.pdb
saveamberparm decharge ligands_decharge.parm7 ligands_decharge.rst7
decharge = combine {cbnz cbnz csolv}
setbox decharge vdw
savepdb decharge complex_decharge.pdb
saveamberparm decharge complex_decharge.parm7 complex_decharge.rst7
# recharge transformation
recharge = combine {lphn lphn lsolv}
setbox recharge vdw
savepdb recharge ligands_recharge.pdb
saveamberparm recharge ligands_recharge.parm7 ligands_recharge.rst7
recharge = combine {cphn cphn csolv}
setbox recharge vdw
savepdb recharge complex_recharge.pdb
saveamberparm recharge complex_recharge.parm7 complex_recharge.rst7
quit
_EOF
生成好这些过程的文件后，使用setup_run.sh来产生三个步骤的输入文件，在修改setup_run.sh时，注意以下部分。
decharge_crg=
":2@H6"
vdw_crg=
":1@H6 | :2@O1,H6"
recharge_crg=
":1@O1,H6"
decharge=
" ifsc = 0, crgmask = '$decharge_crg',"
vdw_bonded=
" ifsc=1, scmask1=':1@H6', scmask2=':2@O1,H6', crgmask='$vdw_crg'"
recharge=
" ifsc = 0, crgmask = '$recharge_crg',"
适配修改，注意H6的都改成初始的ambmask，O1,H6的都改成目标的ambmask，：前面的1或者2不要改。
如有必要修改λ，改变prod.tmpl和setup.sh中的值（0.00922开始的那一串）。
该文件将直接生成所需的slurm文件，并提交到对应的机器上，默认使用g-v100-1，运行pmemd.cuda，大致运行时间1小时左右。
有时候pmemd.cuda会运行失败，此时转用cpu来运行，使用run_mpi.py，提交命令：
python
run_mpi
.py
ligands 500000
mpi
将会检查所有ligands下的文件，对于5分钟内没更新，且info中运行步骤在500000 以下的，会提交到32核CPU机器上运行后续的模拟，直到结束。
这个运行步骤非常缓慢，使用32核CPU算完1纳秒的步骤可能需要7-8天，可以尝试先运行一段CPU，再运行一段GPU，改为python run_mpi.py ligands 500000 cuda即可。
运行结束后，使用alchemical-analysis/alchemical_analysis/alchemical_analysis.py来分析结果，注意该文件在python2下运行。
pip2
install matplotlib
pip2
install scipy
pip2
install numpy
pip2
install pymbar==
3.0
.3
mkdir -p ana_recharge &&
cd ana_recharge
../../alchemical-analysis/alchemical_analysis/alchemical_analysis.py -a AMBER -d . -p ../recharge/[01]*/ti00[1-9] -q out -o . -t 300 -v -r 5 -u kcal -f 50 -g -w
mkdir -p ../ana_decharge &&
cd ../ana_decharge
../../alchemical-analysis/alchemical_analysis/alchemical_analysis.py -a AMBER -d . -p ../decharge/[01]*/ti00[1-9] -q out -o . -t 300 -v -r 5 -u kcal -f 50 -g -w
mkdir -p ../ana_vdw &&
cd ../ana_vdw
../../alchemical-analysis/alchemical_analysis/alchemical_analysis.py -a AMBER -d . -p ../vdw_bonded/[01]*/ti00[1-9] -q out -o . -t 300 -v -r 5 -u kcal -f 50 -g -w
此时只能输出三种变化的结果，将其TI 一列加和得到最终的结果。
如果见到pymbar的warning，只要注释掉对应的assert就可以了。
vim /home/cloudam/.
local/lib/python2.7/site-packages/pymbar/timeseries.py
该应用场景解决将蛋白口袋内的残基A变为残基B所产生的相对自由能变。
首先，使用pymol将分子打开，并选中残基，
使用wizard-mutagenesis-protein完成突变，或者使用命令行完成突变：
load
*.pdb
cmd.wizard(
"mutagenesis")
cmd.do(
"refresh_wizard")
cmd.get_wizard().set_mode(
"GLN")
cmd.get_wizard().do_select(
"86/")
cmd.get_wizard().apply()
cmd.set_wizard(
"done")
save *\out_name.pdb, enabled
将突变前的蛋白（WT.pdb）和突变后的蛋白（L86Q.pdb）的pdb文件上传。使用tleap，读取野生型结构。
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff2
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
zn = loadpdb WT.pdb
check zn
solvateBox zn TIP3PBOX 10
addIons zn Cl- 0
savepdb zn box_check.pdb
quit
记录盒子的范德华半径，并将结构中的水提取出来备用。
python
dry_for_TI
.py
box_check
.pdb
wat
.pdb
WT_receptor
.pdb
同样的方式读取突变型结构，使其保持Amber的原子顺序。
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff2
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
zn = loadpdb L86Q.pdb
check zn
solvateBox zn TIP3PBOX 10
addIons zn Cl- 0
savepdb zn L86Q_leap.pdb
quit
python dry_for_TI.py L86Q_leap.pdb wat1.pdb L86Q_dry.pdb
对比两个去水后的文件，发现由于Amber重编号，突变的残基变为84位，此时使用check_diff_online.py，来保证不是突变的残基的位置都绝对一致，以允许进行TI过程。
python
check_diff_online
.py
L84Q
L86Q_dry
.pdb
WT_receptor
.pdb 84
L86Q_check
.pdb
WT_check
.pdb
再次用tleap读取受体和配体（之前第一部分保存的mol2文件），并读取水盒子，其中ligand是刚才保存的配体（不变部分），m1和m2分别是突变前后的部分（注意突变只改变侧链，不改变主链），注意这里使用了刚才记录的范德华半径。
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff2
loadOff FEN.lib
loadamberparams FEN.gaff2.frcmod
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
ligand = loadmol2 FEN.gaff2.mol2
m1 = loadpdb L86Q_check.pdb
m2 = loadpdb WT_check.pdb
w = loadpdb wat1.pdb
protein = combine {m1 m2 w}
complex = combine {m1 m2 ligand w}
set default nocenter on
setBox protein vdw {39.415 43.577 52.292}
savepdb protein protein.pdb
saveamberparm protein protein.parm7 protein.rst7
setBox complex vdw {39.415 43.577 52.292}
savepdb complex complex.pdb
saveamberparm complex complex.parm7 complex.rst7
quit
使用parmed处理protein.parm7和complex.parm7，以保证正确的所改变的位置提供给TI运算，此处的162为WT或者突变体的残基数，@后面的内容是python get_mutation.py L86Q得到的mapping结果，是在那个突变残基上但也没有变化的残基，84是突变位置，246是84+162。
parmed
protein
.parm7 <<_
EOF
loadRestrt
protein
.rst7
setOverwrite
True
tiMerge
:1-162
:163-324
:84&!@
CA,
C,
O,
N,
H,
HA,
CB :
246&!@CA,C,O,N,H,HA,CB
outparm merged_L86Q_protein.parm7 merged_L86Q_protein.rst7
quit
_EOF
parmed complex.parm7 <<_EOF
loadRestrt complex.rst7
setOverwrite True
tiMerge :
1-
162 :
163-
324 :
84&!@CA,C,O,N,H,HA,CB :
246&!@CA,C,O,N,H,HA,CB
outparm merged_L86Q_complex.parm7 merged_L86Q_complex.rst7
quit
_EOF
python
auto_gene_inp_run
.py 84 162
CA,
C,
O,
N,
H,
HA,
CB
L86Q
来生成tmpl文件（run.tmpl文件需要上传），并将tmpl文件转成真正的ti文件放进文件夹，同时使用slurm提交最小化，加热和运行步骤。
注意，这里直接使用cuda很容易断，可以适当自己修改之前的run_mpi.py来使用cpu续跑中断的模拟。
本案例将实际运行一个蛋白-蛋白相互作用上的突变。我们计算新冠病毒受体结合区域（rbd）到人ACE2受体（ace2）复合物上发生Omicron的突变之一的返回突变A484E后的结合自由能变化。
生成连接了二硫键的大复合体水盒，记录vdw盒子大小，额外加入0.15M/L NaCL （总水数量*0.002772）。
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
zn = loadpdb omi_SS.pdb
bond zn.333.SG zn.358.SG
bond zn.376.SG zn.429.SG
bond zn.388.SG zn.522.SG
bond zn.477.SG zn.485.SG
bond zn.637.SG zn.645.SG
bond zn.848.SG zn.865.SG
bond zn.1034.SG zn.1046.SG
check zn
solvateBox zn TIP3PBOX 10
addIons zn Na+ 0
addIons zn Na+ 80
addIons zn Cl- 0
savepdb zn box_check.pdb
quit
python dry_for_TI.py box_check.pdb wat1.pdb omi_rbd.pdb,omi_ace2.pdb
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
m1 = loadpdb omi_rbd.pdb
bond m1.4.SG m1.29.SG
bond m1.47.SG m1.100.SG
bond m1.59.SG m1.193.SG
bond m1.148.SG m1.156.SG
check m1
solvateBox m1 TIP3PBOX 10
addIons m1 Na+ 0
addIons m1 Na+ 28
addIons m1 Cl- 0
savepdb m1 ligands_recharge.pdb
quit
python dry_for_TI.py ligands_recharge.pdb rbd_wat.pdb test_rbd.pdb
检查输入的是否在TI区域之外没有区别，注意输入的顺序，前面是突变后的蛋白，后面是原始的蛋白。
python
check_diff_online
.py
A152E
A484E_rbd
.pdb
omi_rbd
.pdb 152
A484E_check
.pdb
omi_check
.pdb
设定正确的二硫键，分别加载两种水盒，输出protein和complex的拓扑学文件和坐标文件。
tleap
source leaprc.protein.ff14SB
source leaprc.gaff
source leaprc.water.tip3p
loadamberparams frcmod.ionsjc_tip3p
ligand = loadpdb omi_ace2.pdb
bond ligand.308.SG ligand.316.SG
bond ligand.519.SG ligand.536.SG
bond ligand.705.SG ligand.717.SG
m1 = loadpdb omi_check.pdb
bond m1.4.SG m1.29.SG
bond m1.47.SG m1.100.SG
bond m1.59.SG m1.193.SG
bond m1.148.SG m1.156.SG
m2 = loadpdb A484E_check.pdb
bond m2.4.SG m2.29.SG
bond m2.47.SG m2.100.SG
bond m2.59.SG m2.193.SG
bond m2.148.SG m2.156.SG
w1 = loadpdb rbd_wat.pdb
w2 = loadpdb wat1.pdb
protein = combine {m1 m2 w1}
complex = combine {m1 m2 ligand w2}
set default nocenter on
setBox protein vdw {43.215 53.421 59.922}
savepdb protein protein.pdb
saveamberparm protein protein.parm7 protein.rst7
setBox complex vdw {64.171 75.490 114.587}
savepdb complex complex.pdb
saveamberparm complex complex.parm7 complex.rst7
quit
使用parmed处理protein.parm7和complex.parm7，以保证正确的位置。
parmed
protein
.parm7 <<_
EOF
loadRestrt
protein
.rst7
setOverwrite
True
tiMerge
:1-193
:194-386
:152&!@
CA,
C,
O,
N,
H,
HA,
CB :
345&!@CA,C,O,N,H,HA,CB
outparm merged_A484E_protein.parm7 merged_A484E_protein.rst7
quit
_EOF
parmed complex.parm7 <<_EOF
loadRestrt complex.rst7
setOverwrite True
tiMerge :
1-
193 :
194-
386 :
152&!@CA,C,O,N,H,HA,CB :
345&!@CA,C,O,N,H,HA,CB
outparm merged_A484E_complex.parm7 merged_A484E_complex.rst7
quit
_EOF
python
auto_gene_inp_run
.py 152 193
CA,
C,
O,
N,
H,
HA,
CB
A484E
来生成tmpl文件（run.tmpl文件需要上传），并将tmpl文件转成真正的ti文件放进文件夹，同时使用slurm提交最小化，加热和运行步骤（5ns）。
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