【前沿追踪】光感应交联剂及水凝胶！调控水凝胶降解、蛋白质释放方式和速率！

具有光响应特性的材料尤其是水凝胶具有多种应用，包括自我修复、生物传感、药物输送、聚合物结构和组织工程。基于硝基苄基（NB）交联剂广泛用于细胞培养和其他微生物。虽然如此，人们对微环境特别是密闭的水性环境（例如水凝胶）是如何影响NB部分裂解的方式和速率了解甚少，从而无法控制系统性能的局限性（例如快速水解或缓慢光解）。为了解决这些困难，美国 University of Delaware的April M. Kloxin团队在《JACS》上发表了简单新颖的方法。他们合成了包含不同不稳定键（即酯，酰胺，碳酸根或氨基甲酸酯）NB并表征其光解和水解，并提出NB不稳定键对材料降解的影响的独特见解，这些NB键在水凝胶中充当不稳定的交联键。这些研究为控制光解和水解提供了新的化学方法，对光敏材料（如软材料，纳米颗粒、多肽、蛋白质等）的设计提供了明确的指导。

 

1、设计带有不稳定键的NB交联剂

作者提出了一种简单而创新的方法，通过酯、酰胺、碳酸根或氨基甲酸酯修饰来调节NB交联剂以及其水凝胶的水解和光解速率。他们合成了四种不同的NB不稳定键化学（NB-酯，NB-酰胺，NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯），并通过叠氮化物-炔烃环加成（SPAAC）与PEG-4-DBCO反应合成水凝胶（图1A-B）。对水凝胶的光解和水解进行研究，确定这些不同降解机制在时间尺度差异（图1C-D）。

图1.（A）含有各种不稳定键的硝基苄基（NB），X：氨基甲酸酯（蓝色），酯（橙色），碳酸盐（绿色）或酰胺（粉红色）。（B）由含NB水凝胶的光降解及水降解。（C）通过SPAAC反应在PEG-4-DBCO和NB叠氮化物聚合形成三唑键，以此合成水凝胶。（D）在紫外光（365nm）照射下，NB光裂解导致水凝胶降解。（E）水凝胶在水性环境中降解的能力。

 

2、水凝胶的光解

通过测试光照射对水凝胶储能模量（G’）的影响，作者研究了含四种不稳定键的NB交联剂的光解速率。光照导致键断裂，水凝胶完全降解（即当水凝胶不再能够存储应力时）。水凝胶的储能模量与交联密度直接相关，可对一阶反应动力学模型进行建模。具体来说，将标准化G’的自然对数相与时间作图，并进行线性回归拟合，可以确定水凝胶中每个交联剂的有效一级光降解常数，通过有效一级光降解常数除以二就可获得水凝胶中NB部分的光降解速率k。通过使用这种方法，他们发现在由NB氨基甲酸酯光降解速率最快，其次是NB酯，NB-碳酸根，最后是NB-酰胺（图2B）。

为了比较溶液和水凝胶交联中的NB之间的光降解差异，作者通过研究了含有5％氘化DMSO和PBS盐溶液的水凝胶的NMR来评估NB基团的光降解动力学。他们观察到NB-酰胺在溶液中的光降解速度最快，其次是NB-氨基甲酸酯，NB-酯和NB-碳酸酯。NB-酯，NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯键在溶液和水凝胶之间的光降解速率没有显着差异，但是NB-酰胺水凝胶光降解速率显着降低（图2B）。NB-氨基甲酸酯在水凝胶中的光降解速率明显快于其他NB交联剂的光降解速率。作者提出当NB-酰胺在密闭环境（如树脂或水凝胶）中充当交联剂时，由于光散射，阴影效应和/或溶胀/溶剂化的影响，光降解速率会大大降低。与在溶液中相比，NB-酰胺在水凝胶的光降解速率降低，这可能使由于水凝胶网络限制酰胺键的活化。在水凝胶中加入疏水性分子时，NB-酰胺在水凝胶的光降解速率没有明显降低。NB基团在光引发的光致异构化（Norrish II型）反应中产生的中间体会导致光降解减慢。水凝胶网络对酰胺键的限制导致键构象和水合变化，这增加光异构化反应所需的热力学驱动力。NB-酰胺交联剂在水凝胶中光降解速率不够快仍是在某些特定应用中的挑战。

另一个观察结果是NB-酰胺水凝胶在连续照射后30分钟内未完全降解，而带有其他不稳定键NB的水凝胶均完全降解。这种不完全降解是酰胺参与Norris II型反应而导致中间体发生位移引起的。作者用羰基清除剂（氨基脲）使NB-酰胺水凝胶进一步完全降解，这种清除剂有助于光裂解。

图2.小分子和水凝胶的光降解速率。（A）水凝胶主链中的NB在365nm光照射下的β消除反应。（B）小分子和水凝胶紫外光（365 nm）照下的一阶光降解速率和量子产率。

 

3、水凝胶的水解

NB不稳定键的水解也可使水凝胶在较长时间内降解。为了研究水凝胶对在不同水环境水解的差异，作者将水凝胶浸泡在PBS （pH = 10）中，并在72 h内测量水凝胶体积（图3）。在此条件下，水凝胶降解导致水凝胶体积增加（Q = V/V0），直到单链不再支撑网络时水凝胶完全降解。NB-酯水凝胶在缓冲液中1小时内便快速溶胀，然后完全降解（图3）。NB-酯水凝胶水解速率最快，其次是NB-碳酸酯和NB-酰胺。NB-氨基甲酸酯水凝胶没有明显水解。NB-酯同时表现出快速的光降解和水解，而NB-酰胺则表现出较慢的光降解速率和较快的水解。NB-碳酸酯和NB-氨基甲酸酯具有与常见的NB不同的降解特性。NB-氨基甲酸酯具有快速光降解速率和极慢速水解速率。NB在生理条件下仍然水解，将水凝胶浸泡在PBS（pH = 7.4，含有1％青霉素/链霉素和0.2％真菌区）中，NB-酯在21天之内降解，NB-碳酸水凝胶在49天之内降解，NB-酰胺和NB-氨基甲酸酯未发生明显变化。这对设计光降解水凝胶非常重要。

图3. 水凝胶的水解。（A）NB基团的可裂解键（X）决定了水凝胶的水解速率和形成的产物，Z1和Z2分别代表形成的产物。（B）水凝胶在pH ＝ 10的PBS的体积变化。

 

4、NB交联剂水凝胶释放蛋白质

作者最后设计了具有双重功能的同心圆柱状水凝胶，利用不同的NB交联剂的水解和光解特性，以控制蛋白质释放。将不同荧光团标记的模型蛋白（BSA-Alexa Fluor（AF）488和BSA-AF647）分别加入NB-酯和NB-氨基甲酸酯水凝胶前体溶液中，然后在同心圆柱体模中依次形成水凝胶层。选择NB-酯和NB-氨基甲酸酯是因为它们具有相似的光解行为及相反的水解行为，这提供了创建组合及顺序释放的机制。水凝胶光降解速率在共聚焦显微镜下进行检测，发现两个水凝胶层内的荧光强度均以相似的速率降低（图4A），并且水凝胶相对高度在照射后降低（图4B）。

 

图4.双功能同心圆柱水凝胶组合的蛋白释放。（A）同心圆水凝胶随光照时间的变化。（B）在0分钟（左），7.5分钟（中）和12.5分钟（右）时，同心圆柱状水凝胶的表面（顶部）和侧面的图像。比例尺500 µm。

 

接着，他们将水凝胶浸泡在PBS（pH = 10），NB-酯水凝胶层降解并释放BSA-AF488。随后用紫外光照射剩余的水凝胶以降解NB-氨基甲酸酯水凝胶层并释放BSA-AF647。在碱性缓冲液中浸泡60分钟后，NB-酯层的荧光强度降低，释放出BSA-AF488，随后在紫外光照射下NB-氨基甲酸酯层迅速释BSA-AF647（图5）。这证实了水凝胶中NB交联剂的不同降解方式和速率在控制封装及释放的实用性。作者展示了一种通过简单的过程来导向释放的简便方法，这种方法为设计具有可调节和可控制特性的可降解材料提供了新的思路和机会。

图5.从双重功能的同心圆柱水凝胶依次释放蛋白质。（A）NB-酯水凝胶层（绿色）在碱性条件下降解，而NB-氨基甲酸酯水凝胶层（紫色）在光照射才观察到降解。 （B）在0分钟（左），60分钟（中）和75分钟（右）的水凝胶图像。比例尺500 µm。

参考文献：https://doi.org/10.1021/jacs.9b11564