前沿进展 | 多焦点光场显微成像技术

研究背景

      对高动态生物现象的三维可视化技术对于人们探索生命系统至关重要。在过去的几十年里，研究者们开发了多种快速、高质量的体成像方法，其中光场显微成像技术（light-field microscopy, LFM）由于其高并行性和低光毒性受到研究者的青睐。通过在光路中加入微透镜阵列（microlens array, MLA），LFM可以在单次拍摄中对三维空间内的高维光信息进行编码。通过配套的反解算法，可以以高保真度还原场景的三维信息。然而，LFM的分辨率与体覆盖率相互制约，重建三维体的分辨率随着离焦距离的增大而快速下降，这阻碍了LFM在大范围活体场景下的应用。为了突破这一限制，研究者们提出了一些方法，包括使用双聚焦微透镜阵列[1]或者采用共聚焦光场显微系统[2]等等，但是这些方法增加了系统的复杂性。如何低成本地扩大光场成像的高分辨率范围仍是一个充满吸引力的课题。

论文导读

      近日，来自清华大学脑与认知科学研究院、自动化系的研究团队提出了一种多焦点同步采集的球差辅助扫描光场成像方法(Spherical-Aberration-assisted scanning LFM, SAsLFM)。在先前提出的扫描光场技术的基础上[3,4]，研究人员利用折射率不匹配引入球差相位调制，对不同子孔径分量焦点的空间位置进行再分配，从而实现同步多焦点体数据采集。通过相空间分块融合的重建算法，可以从SAsLFM采集所得的高维光场数据中抽离出不同深度的高分辨信息并进行匹配融合，以此还原大尺度高分辨的三维体信息。定量实验证明：在不需要额外硬件辅助的情况下，SAsLFM可以将成像体的高分辨轴向范围扩展3倍。同时，文章进行了大量的生物实验展示了SAsLFM的成像性能：包括对300 μm厚的活体小鼠脑进行高信噪比钙信号提取，以22Hz的体成像速率在2000×2000×500 μm³的视野范围内对自由移动水母进行动态追踪等等。进一步的，该研究还通过深度学习方法将重建速度提升3个数量级，实现了大通量三维信息实时可视化。该研究于2022年11月30日发表于PhotoniX。

技术突破

      非聚焦扫描光场显微系统往往含有几十个甚至上百个子孔径分量(图1a)。在理想系统中，不同子孔径分量对应的高分辨率轴向范围完全相互重叠，因此存在大量的数据冗余。在对光场成像的物理模型进行分析后，研究人员发现在相空间下，不同子孔径分量之间保持相对独立，即可以通过合理的相位调制将不同子孔径的焦点位置进行重排，即在轴向上将不同子孔径分量的焦点位置错开，以此扩展单次采集的高分辨率轴向范围。球差作为一种常见的光学畸变，在传统的成像系统中并不收欢迎。但对于光场成像系统而言，通过折射率不匹配来引入球差是一种简单有效的重排子孔径焦点的方法。如图1b所示，在光瞳面加入一个理想的中心对称球差，各子孔径分量的聚焦深度由子孔径位置与光瞳面中心的相对距离决定，导致各子孔径分量的轴向高分辨率位置偏移，能量被重新分布。通过适当的重建算法合并所有角度的信息，则可以获得扩展景深的高分辨率大尺度重建体（图1c）。

      研究人员首先使用10× /0.28NA长工作距离干镜对USAF-1951分辨率板成像，以此定量实验来说明SAsLFM的成像性能。如图2中所示，sLFM的分辨率随着离焦距离的增大而快速下降，而SAsLFM在轴向上显著延续了高分辨率覆盖范围。SAsLFM在-600 μm -200 μm的轴向范围内维持了高于3.91 μm的分辨率水平, 并且削弱了焦面处的伪影。

     在扩展轴向高分辨率范围的同时，SAsLFM还具有高速和低光毒性的成像优势，因此尤其适用于观测生物样本中的大尺度三维结构和动态。研究者使用SAsLFM对多种模式生物进行成像，包括对斑马鱼全身脉管系统重建，对小鼠脑进行大范围(2000×2000×330 μm³)钙信号提取以及对果蝇卵的发育过程进行长时(~6.5 h)观测等等。此外，研究人员还对自由活动的水母水螅体进行三维追踪。在之前相关的研究中，研究者都需要采用一定的方式将水母固定，以此保证水母在成像范围内。而SAsLFM拥有大尺度高分辨的视野范围，因而可以允许样本在一定范围内自由活动。研究人员在2000×2000×500 μm³视野范围内以22Hz对自由活动的水母水螅体进行高速体成像，并且成功追踪到了水螅体触手的三维运动轨迹(图3)。此外，随着计算硬件的不断改进和多种方法的开源，深度学习已经成为图像解卷积的有力的替代方法。研究者提出了一种基于U-Net的相空间解卷积算法，将重建速度提升了3个数量级，实现了实时三维信号可视化。

观点评述

      SAsLFM不仅继承了sLFM高速、低光毒性的优点，并进一步优化了sLFM的采集模式，利用子孔径分量的冗余性提升了三维成像的高分辨率范围，并且削减了重建伪影。此外，SAsLFM提供了一种非常实用的思路，即在相空间中优化子孔径点扩散函数，这样就避开了空域非连续PSF难以优化的问题。这种相位调制方式使得sLFM技术更具灵活性。在后续的工作中，研究人员将探索更复杂的相位编码，进一步优化sLFM的成像性能，推动高质量大范围活体三维成像技术的发展。

主要作者

      戴琼海，教授，博士生导师。清华大学信息学院院长、中国工程院院士、中国人工智能学会理事长。从人工智能立体视觉、计算成像到脑与认知开展了基础理论与关键技术系列研究，承担了国家973、重大仪器和基础科学中心等项目。在Nature, Cell, Nature Biotechnology, Nature Methods, Nature Photonics等发表论文百余篇，培养研究生百余名。获国家技术发明一等奖、国家科技进步奖二等奖、全国高校黄大年式教师团队。

      季向阳，清华大学自动化系教授，获国家杰出青年科学基金、国家“万人计划”领军人才、中国青年科技奖等人才奖励。主要研究方向为光学成像、视觉信号获取与智能处理等。主持基金委重大科研仪器研制项目“散射场景编码摄像仪器”、科技部重点研发计划“无人系统自主智能精准感知与操控”等一系列国家重大科研项目。发表Nature Communications、IEEE TPAMI、TCI、NIPS、CVPR等SCI/EI论文100余篇；授权国家/国际发明专利70余项，获得2018年纽伦堡国际发明展金奖 2 项，2022年日内瓦国际发明展金奖1项；获2019年国家科技进步二等奖1项（第一完成人），2012年国家技术发明一等奖1项（第二完成人）。

      吴嘉敏，清华大学自动化系助理教授，博士生导师，清华-IDG/麦戈文脑科学研究院，研究员。致力于计算成像、显微仪器与跨尺度数据理解的交叉研究，提出了扫描光场成像原理与数字自适应光学架构，参与研制系列计算光场成像仪器，为系统性地研究哺乳动物在体大规模细胞间相互作用提供了利器。主持基金委优秀青年科学基金项目、面上项目、科技部颠覆性技术专项等，获阿里巴巴达摩院青橙奖，入选亚太区TR35，近五年在Cell、Nature、Nature Photonics等期刊发表论文40余篇，授权发明专利30余项。